UNA HERRAMIENTA PARA ESTUDIO

(Fig.3). El estudio 3D de proteínas conduce a la comprensión de los procesos a su nivel más básico: interacciones, catálisis enzimática, acción de drogas, etc.

El proceso de determinación de estructuras 3D incluye varias etapas: purificación de la proteína en estudio, su cristalización, recolección de datos, solución de la estructura (ajuste de fases), determinación estructural mediante la construcción de un modelo y su refinamiento.
Cuando deseamos “ver” un objeto, necesitamos iluminarlo con radiación de una longitud de onda equivalente al tamaño del objeto a visualizar, o menor. Para ver objetos cotidianos, la luz visible que tiene una longitud de onda del orden de los 5000 Angstroms (1 Angstrom = 10-8 cms.) nos permite ver objetos hasta 10-3 cms. aproximadamente, es decir células y algunos de sus componentes. Pero si queremos estudiar objetos y estructuras a nivel atómico, debemos recurrir a longitudes de onda mucho menores, de 0,1 a 10 A, esto es, a rayos X.
El problema es que como tampoco se cuenta con placas y cámaras para esas dimensiones, se debe recurrir a un artificio que es ver la difracción que el objeto produce frente al haz de Rayos X y mediante un elaborado método matemático conocido como deconvolución o Transformada Fourier, reconstruir la forma del objeto original.
Para complicar más aun las cosas, la intensidad de luz difractada por una molécula es muy baja; entonces se recurre a un segundo artificio consistente en colocar muchas moléculas idénticas en posiciones idénticas frente a los Rayos X y sumar muchas pequeñas intensidades. Esto no es ni más ni menos que construir un cristal donde cada celda unidad contiene unas pocas proteínas y el efecto sumado de muchas celdas unidad nos da un patrón de difracción útil para la determinación estructural. Para tener una idea aproximada del efecto cristalográfico, un cristal de 1 mm3 puede contener entre 100.000 y 1.000.000 de moléculas.
Cuando la radiación incide sobre el cristal, sólo aquellos ángulos de incidencia para los cuales todas las radiaciones difractadas se encuentren en fase, se reforzarán. Para todo otro ángulo se anularán, Esta es la conocida Ley de Bragg:

A medida que se cambia el ángulo de incidencia van apareciendo numerosas difracciones en fase, porque son muchos los planos internos del cristal que las generan (habitualmente entre 5000 y 50.000). El conjunto de esas difracciones genera un diagrama, conocido como Diagrama de Laue (Fig. 2).

La siguiente etapa, a partir del diagrama es determinar la densidad de electrones. Con ella, varios métodos permiten resolver la estructura de la proteína. Todos ellos parten de un hecho matemático: si se conoce la estructura, se puede generar un patrón teórico de difracción.
El primero es el método del reemplazo. Si dos proteínas tienen secuencias similares hasta en un 30% o contienen dominios similares, se toma como punto de partida la de estructura conocida y se va refinando la nueva estructura hasta que el diagrama teórico de puntos difractados coincida con el medido. No siempre este método es efectivo: proteínas la ligante a DNA de Aquifex aeolicus y el citocromo C4 de la Pseudomona aeruginosa no pudieron ser resueltos a pesar de contar con proteínas similares en un 75%.
El siguiente método consiste en agregar a las proteínas en estudio un metal pesado como impureza (MIR: Multiple Isomorphous Replacement). Los más utilizados son Cromo y Mercurio. Comparando los patrones de difracción de ambos cristales se puede resolver la ecuación de las posiciones de los metales pesados. De ahí, comparando diagramas se resuelven las fases de las distintas ondas. Con ellos se construyen mapas de densidad electrónica y su interpretación permite inferir partes de la estructura. La imagen de difracción y las fases con que llegan los haces luminosos son los elementos que requiere el método Fourier para reconstruir la estructura. Con una parte de la estructura resuelta se van refinando los datos en un proceso interativo que depende fuertemente de la resolución con que se cuente (Fig. 3).
El método MAD, Multiwavelength Anomalous Dispersion, requiere radiación de un sincrotrón de manera que los datos pueden ser acumulados a diversas longitudes de onda. A mayor velocidad de aceleración de las partículas que impactan en un blanco, menor la longitud de onda de los Rayos X generados.
A ciertas frecuencias de resonancia, algunos átomos pesados tales como Fe, Se, Hg, Pt, I absorben radiación y producen diversas intensidades de difracción. Los datos obtenidos para un mismo cristal permiten calcular las posiciones de los átomos anómalos, de allí las fases y la estructura de la proteína. Cuanto mayor la intensidad, mejor será la determinación de las posiciones atómicas.
De allí la necesidad de obtener haces de rayos X de la más alta energía y menor longitud de onda posible. Gigantescas instalaciones del SRLRC (Research Council, Inglaterra), ESRF (European Synchroton Radiation Facility, Grenoble, Francia) y otras más existentes en Luxemburgo, Lichenstein y Amsterdam han provisto a investigadores de todo el mundo de una poderosa herramienta para análisis cristalográfico.
La instalación próxima a inaugurarse en Brasil, en la ciudad de Campinas, a unos 100 kilómetros de San Pablo, es el Laboratorio Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). Este centro pionero está construyendo en la actualidad uno de los sincrotrones más potentes del mundo que proveerá a los investigadores de América Latina de una invalorable herramienta de investigación y desarrollo de nuevos fármacos. (Por el Dr. Enrique D’ Alessio).